GEN ANTITUMORAL-P53

D: vinculante y la
CONTROL DE transcripción del gen de

Bioquímica - DR. JAKUBOWSKI

Última actualización: 04/26/09

Objetivos de aprendizaje y objetivos para el capítulo 5D: Después de la clase y esta lectura, los estudiantes serán capaces de describir los mecanismos generales de cómo un gen de una proteína puede ser positiva y negativamente regulado a nivel de la transcripción de genes; describir la estructura de / / la función del rol de los promotores, los elementos de respuesta, la RNA polimerasa, los factores de transcripción, los nucleosomas, proteínas histonas, modificaciones epigenéticas del ADN en la transcripción de genes; Explicar las diferencias (estructurales, KDS) entre específicos y no específicos de unión de un ligando a una macromolécula, en el nivel estructural; describir las características estructurales de las proteínas y el ADN que resultan en específicos y no específicos vinculante; Describir y dar ejemplos de cómo modificaciones post-traduccionales de proteínas y Epigentics cambios del ADN pueden alterar la expresión de genes; explicar cómo la Ke aparente para una proteína de unión al ADN puede ser alterado por la presencia de otra proteína unida a ADN en un sitio proximal describir la base de la interferencia de ARN en la expresión génica

Imagínese que usted ha dado una cadena de aproximadamente 3 metros de largo, que representan una desenrollada, desproteinizado, el cromosoma humano. En realidad, el ADN desnudo tal no existe en el núcleo de la célula. Por el contrario, se enrolla alrededor de una serie de proteínas histonas cargado positivamente, en el microscopio electrónico se asemeja a cuentas de un rosario. Esta estructura es la herida en una estructura cilíndrica "solenoide" ¿Cuál es más envasados para encajar en el núcleo junto con el resto de los cromosomas. No sólo pasa a ser un pequeño punto en el centro muerto de la cadena que se han dado. Representa el gen para una proteína particular llamada metalotioneína. Este gen se expresa y la metalotioneína proteína se produce cuando las células están expuestas a metales pesados como el CD de su trabajo de hoy es encontrar una manera posible (hay muchos) en la que las células no expresan el gen, o expresar a un pequeño, constituit nivel, en ausencia de exposición al Cd, y la forma en que el gen podría ser activado - a través de la transcripción de los genes y la traducción del ARNm resultante para formar la metalotioneína proteínas sobre la exposición a Cd (Sugerencia: Cd Doe directamente, no se unen al ADN). Proporciona mecanismos para hacer frente a las siguientes preguntas. No ofrecen ningún mecanismo mágico:

1. Como expresión de los genes podría ser reprimida en la ausencia de lista de CD algunas posibilidades.
2. Como expresión de los genes pueden ser activadas por la presencia de Cd

Una de las cuestiones centrales de la biología moderna es lo que controla la expresión génica. Como hemos descrito anteriormente, los genes deben ser "activada" en el momento adecuado, justo en la celda. En una primera aproximación, todas las células de un organismo contiene el mismo ADN (con la excepción de las células germinales y las células inmunes). Tipo de célula está determinada por lo que los genes se expresan en un momento dado. Del mismo modo, las células pueden intercambiar (Diferenciar) En diferentes tipos de células, alterando la expresión de los genes. El dogma central de la biología se describe cómo los genes se transcribe primero al ARN mensajero (ARNm), y luego el ARNm se traduce en una secuencia de la proteína correspondiente. Los enlaces a continuación debe ser revisado por quienes tienen poco fondo en el dogma central de la biología y de la naturaleza de un gen.

• Listado de dogma central de la Biología de la no-bioquímica importante
• Una vista de los genes y sus productos: Simplicidad a la complejidad

Jmol:Simples de ADN Tutorial 

Las proteínas pueden entonces ser posterior a la translacionalmente vez, localizado en determinados sitios dentro de las células, y en última instancia, degradados. Si las proteínas funcionales se considera el producto final de la expresión genética, el control de la expresión génica en teoría, podría ocurrir en cualquiera de estos pasos en el proceso.

Figura: procesos que afectan la concentración en estado estacionario de una proteína

 

En su mayoría, sin embargo, la expresión génica está controlada a nivel de la transcripción. Esto tiene sentido biológico grande, ya que sería menos residuos con energía para inducir o inhibir la expresión última de una proteína funcional en un primer paso en el proceso. ¿Cómo puede ser expresión de genes regulados a nivel transcripcional? Muchos ejemplos han sido documentados. El control principal suele ser ejercida en el nivel de ARN polimerasa vinculante aguas arriba (5 ') de un sitio para la iniciación de la transcripción. Otros factores, llamados los factores de transcripción (que son generalmente proteínas) se unen a la misma región y promueven la unión de la RNA polimerasa en su sitio de unión, denominada promotor. Las proteínas pueden también unirse a los sitios en el ADN (operador en procariotas) e inhibir el ensamblaje del complejo de transcripción y por lo tanto, la transcripción. Regulación de la transcripción del gen se convierte en una cuestión de carácter vinculante los factores de transcripción adecuada y la RNA polimerasa a la región apropiada en el lugar de inicio de la transcripción de genes. Regulación de la expresión génica por las proteínas puede ser positivo o negativo. Reglamento en procariotas suele ser negativa, si bien es positiva en los eucariotas.

Figura: Reglamento positivos y negativos de la transcripción del gen de

 

De Control de la transcripción de genes en procariotas: la E. ICV ALC OPERÓN

La regulación de los genes implicados en la utilización de la lactosa ganó Jacob y Monod (de la fama MWC) el Premio Nobel. A la lactosa puede ser utilizado como la única fuente de carbono por E. Coli. Tres genes son necesarios para la utilización de la lactosa, la beta-galactosidasa (Z ALC, se unirá a la lactosa con Gal y GLC), permeasa galactósido (Lac Y, transporte lacustre en la célula) y transacetilasa Tiogalactósido (Lago A, desconoce la función). Estos genes se suceden en el ADN, y tienen 1 región promotora. Una transcripción y traducción, una poli larga proteína que se haga, que se escinde post-translacionalmente para formar las proteínas individuales.

Figura: Función de las proteínas en la utilización de Galactosa  

 

Además, otro gen, el represor Gal, se encuentra justo arriba de la utilización de genes de Gal. Tiene su propio promotor (P_I). Un grupo de genes, incluyendo cualquier promotor y secuencias reguladoras de ADN se denomina operón, Por ejemplo, el operón Lac. En este caso, la transcripción del operón es inducido en respuesta a una señal molecular - es decir, la presencia de lactosa, o alolactosa. La señal se une a la proteína represora, que está unida a la operador De ADN, que en ausencia de la señal inhibe la transcripción. Cuando la señal en este caso o en otro beta-alolactosa galactósidos, como isopropylthiogalactoside (IPTG) se une a la proteína represora, se produce un cambio conformacional en el represor, lo que resulta en una mayor Kd para el ADN del operador, y la disociación posterior de la galactósido complejo represor. Sobreviene la transcripción.

Figura: IPTG y la lactosa estructuras

 

IPTG es un inductor de la meta operón lac no es un sustrato de las enzimas producidas. Usaremos IPTG para inducir la expresión de los adipocitos b fosfatasa ácida (HAAP-b) en el 4B de laboratorio. El plásmido contiene el gen de la b-HAAP ha sido diseñado para contener el promotor lac justo antes del punto de inicio de la transcripción de genes. Mediante la adición de IPTG a las células en crecimiento, las células pueden ser inducidas a sintetizar la proteína, HAAP-b.

Figura: ADMISION DE ALC OPERÓN

 

Muchos análoga a métodos distintos se utilizan para controlar la transcripción de genes en procariotas. El control de la lac operón objetivo de transcripción es un ejemplo.

CONTROL DE LA TRANSCRIPCIÓN DE GENES EN EUCARIÓTICA

Tres grandes diferencias existentes en los mecanismos de control para regular la transcripción de genes en las células eucariotas en comparación con los procariotas.

• Varios cambios se producen en la estructura de la cromatina en el sitio de la transcripción
• positivamente los mecanismos de regular la transcripción mucho más a menudo que los negativos.
• la transcripción y traducción se producen en el espacio y en sitios separados temporalmente y los tiempos.

Los genomas de eucariotas son mucho más grandes que los procariotas. Esto plantea algunos problemas con respecto al carácter vinculante. Recuerde, las proteínas de unión a ADN demuestran tanto específicos y la unión específica. La unión no específica de una proteína puede ayudar a encontrar un lugar específico en el genoma, sino como el tamaño de los aumentos del genoma, la posibilidad de encontrar varios sitios específicos aumenta distribuyen al azar. Este problema se puede evitar si las proteínas se necesitan múltiples para generar un complejo de transcripción activa. La probabilidad de encontrar dos o más sitios específicos para las distintas proteínas en la proximidad de otros sitios que los requeridos para la transcripción de genes son muy bajos. Múltiples reguladores negativos no sería necesario puesto que la unión de un solo regulador, probablemente sería suficiente. La mayoría de los genes eucariotas tienen alrededor de 5 sitios de regulación vinculante para los factores de transcripción y la ARN polimerasa. Ejemplos de estos factores de transcripción pueden verse en la siguiente figura.

Figura: De control de la transcripción de genes de la globina

 

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Figura: Ejemplo de complejo de transcripción

 

Claro, incluso puede regular la expresión génica indirectamente mediante la activación de un factor de transcripción inactivos en las plantas. PIF3 El factor de transcripción se une a una región promotora (G-box) de la luz-genes de respuesta. Sólo cuando PIF3 se une otro facotr transcripción, Pr, se activa la transcripción. Pr, un fotorreceptor "se encuentra en una forma inactiva en el citoplasma. Cuando se absorbe la luz roja, undegoes un cambio conformacional y se desplaza hacia el núcleo, donde puede de obligar a PIF3 y activar la transcripción. El complejo de activación se desactivará cuando Pr interactúa con la luz roja lejana.

Figura: Al absorber la luz roja, un fotorreceptor fitocromo se convierte de la forma Pr inactiva a la forma activa Pfr

 

• información p53 del HHMI
• Animación: la transcripción del gen p53 y del HHMI (carga lenta)

Características estructurales de los sitios de unión específica de ADN

Dado que la RNA polimerasa debe interactuar en el sitio promotor de todos los genes, se podría esperar que todos los genes que tienen una secuencia de nucleótidos similares en la región del promotor. Esto resulta ser cierto tanto para procariotas y eucariotas los genes. Es de esperar, sin embargo, que todos los factores de transcripción no tendría carácter vinculante secuencias de ADN idénticos. Las secuencias de ADN aguas arriba del punto de inicio del gen que une a las proteínas (ARN polimerasa, factores de transcripción, etc) se llaman Promotores. La siguiente tabla muestra el motivo de secuencia de ADN común llamado Pribnow o caja TATA encuentra en alrededor del 10 pares de bases río arriba del sitio de inicio y otra a -35. Proteínas se unen a estos sitios y facilitar la unión de la RNA polimerasa, lo que gen transcripton.

Procariotas Secuencias promotoras

Promotor	-35 Región	Spacer	-10 Región	Spacer	Inicio ARN
operón trp	TTGACA	N17	TTAACT	N7	Tiene
tRNAtyr	TTACA	N16	TATGAT	N7	Tiene
LP2	TTGACA	N17	GATACT	N6	G
operón lac	TTTACA	N17	TATGTT	N6	Tiene
recA	TTGATA	N16	TATAAT	N7	Tiene
A lex	TTCCAA	N17	TATACT	N6	Tiene
T7A3	TTGACA	N17	TACGAT	N7	Tiene
consenso	TTGACA		TATAAT

La caja TATA en prokayotes también es conocida como la caja Pribnow. Una secuencia similar se encuentra en las células eucariotas (consenso TATAAA) situado a unos 25 nucleótidos aguas arriba del inicio de la transcripción. También se le llama la Goldstein-Hogness.

Jmol:Tata Box Binding Protein 

Además, en los eucariotas, las secuencias de una fase previa llamada los elementos de respuesta unirse a las proteínas específicas (tales como CREB o AMP cíclico elemento de respuesta de la unión a proteínas) para seguir la transcripción de genes de control.

Eucarióticos Elementos de respuesta (RE) s

De regulación oficial	Módulo	Consenso	De ADN de la envolvente	Factor	Tamaño dalton ()
Choque térmico	HSE	CNNGAANNTCCNNG	27 pb	GTPA	93,000
Glucocorticoides	GRE	TGGTACAAATGTTCT	20 pb	Receptor	94,000
Cadmio	MRE	CGNCCCGGNCNC	.	?	.
Éster de forbol	TAR	TGACTCA	22 pb	AP1	39,000
Suero	SRE	CCATATTAGG	20 pb	SRF	52,000
Antioxidante	AER	GTGACTCAGC
Feromona (hongo)		ACAAAGGGA
Hipoxia	Educación en Derechos Humanos	CCACAGTGCATACGT GGGCTCCAACAGGTC CTCTCCCTCCCATGCA		Hipoxia inducible factor	826 bis
Receptor activado por proliferador de peroxisomas (PPAR)	PPRE	tieneGG_CTieneAAGGT (CG) A		PPAR	59,000
Esteroides (general) (progesterona, andrógenos, mineralcorticoids, glucocorticoides		AGAACAxxxACAAGA (repetición invertida)

Las proteínas pueden interactuar específicamente con el ADN a través de electrostática, H-bonos y las interacciones hidrofóbicas. Pares de bases AT y GC disponer de H dadores y receptores de los que están expuestos en el bosque de mayor y menor de la hélice de ADN DS, permitiendo que la proteína específica de ADN interacciones .

Figura: Pares de bases AT y GC disponer de dadores y receptores de H

 

Jmol:Simples de ADN Tutorial(ver los botones de selección pasado para ver dadores y receptores de H en el bosque de los principales.

Jmol:ARN polimerasa II / ADN / ARN del complejo.

 

La transcripción del gen, la proteólisis y lípidos de membrana

Un ejemplo interesante de control de la transcripción se produce para mantener el equilibrio de los lípidos en las membranas biológicas. Los fosfolípidos y esfingolípidos en las membranas son muy heterogéneas, debido a la diversidad de los grupos de cabeza y la composición de la cadena de acilo. Habida cuenta de esta gran diversidad, hay que destacar las diferentes células son capaces de mantener la especificidad de los tipos de lípidos en células diferentes, en diferentes membranas de las células, y dentro de un prospecto dado de una membrana (recordar nuestra discusión de las balsas de lípidos). ¿Cómo puede la célula de regular el tipo de lípidos que sintetiza? ¿Qué controla la transcripción de genes para la síntesis de lípidos?

Regulación de la transcripción de estos genes parece estar controlada por las proteínas multidominio que se unen a los elementos de respuesta de esteroles en el ADN. La proteína, llamada STerol RESPUESTA EIng. Bncontrar PROTEIN (SREBPs) Son activados por proteólisis para liberar un factor de transcripción que de dominio migra al núcleo. Proteólisis de SREBP se produce en el aparato de Golgi por proteasas residentes. El SREBP en el aparato de Golgi es un complejo con otra proteína, la escisión SREP activador de la proteína (SCAP), que facilita el movimiento de la SREBP para el aparato de Golgi, de su lugar de síntesis en el retículo endoplásmico. regulación de los lípidos se produce cuando los ácidos grasos, colesterol, o los derivados como Fosfoetanolamina PL (de ceramidas) inhibe la activación proteolítica de SREBP. Reglamento depende de si el comandante supremo "ferry" SREBP al aparato de Golgi. Parece que se une el comandante supremo de SREP y lo transfiere a la membrana de Golgi, pero sólo cuando los niveles de esteroles son bajos. Cuando el colesterol es elevado, se une al dominio de transmembrana y el comandante supremo comandante supremo impide la interacción con SREP y transferirla a la de Golgi.

La auxina, una hormona de la planta principal que induce la expresión del gen también parece activar la transcripción a través de la proteólisis. Cuando se une a sus receptores solubles del citoplasma, la proteína ubiquitina ligasa SCF^TIR1, Se activa la proteólisis de la proteína que inhiben la transcripción.

Jmol :Auxina Receptor

Características estructurales de la ADN-Proteínas de Unión

No cualquier proteína puede unirse específicamente al ADN. Análisis de las proteínas de unión a ADN muestra patrones comunes se encuentran entre ellos.

• hélice-giro-hélice: Se encuentra en proteínas de unión a ADN de procariotas.

Figura: hélice-giro-hélice

 

La figura muestra dos de estas proteínas, el represor cro represor de 434 y el bacteriófago lambda de las bacteriófago lambda. (Bacteriófagos son virus que infectan a bacteia.) Observe cómo se logra la especificidad, en parte, por la formación de H específicos lazos entre la proteína y la arboleda mayor del DNA del operador.

Figura: Lambda represor / DNA Complex

 

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Figura: Interacciones de enlace entre H l represor y el ADN

 

Chime:Lambda-represor Complejo Jmol:Lambda-represor Complejo

• dedos de zinc: (Eucariotas) Estas proteínas tienen un motivo de secuencia común de
  X₃--Cys-X_2-4--Cys-X₁₂--Su-X_3-4--Su-X_{4 --} en la que X es cualquier aminoácido. Zn^{2 +} Tetraédricamente se coordina con el Cis y sus cadenas laterales, que están en una de las dos cadenas beta antiparalelas y una hélice alfa, respectivamente. El dedo de zinc, estabilizado por el zinc se une al surco mayor del ADN. ]

Figura: dedos de zinc

 

Chime:Zif268: Complejo de ADN   Jmol:Zif268: Complejo de ADN

Proteínas con dedos de zinc, de los cuales 900 están codificados en el genoma humano, se pueden movilizar para la reparación real de mutaciones específicas en las células, que si se realiza en un porcentaje bastante elevado de células mutantes podían curar enfermedades genéticas específicas, tales como algunas formas de inmunodeficiencia combinada severa enfermedad. Con esta nueva técnica (Urnov et al, 2005), varios dominios de dedos de zinc vinculados vinculantes (uno de los naturales de los que ocurren o formas mutantes producidos en el laboratorio), cada uno específico para una determinada secuencia de nucleótidos, está ligada a ha endonucleasa nonspeciifc, derivado de la enzima FokI. La nucleasa está activo en forma dimérica de modo que el complejo activo requiere de dos dominios endonucleasa, cada uno unido a cuatro diferentes dominios dedo Zn, para montar en el lugar de destino. especificidad de la unión se logra mediante la selección los dominios de los dedos de Zn. Un nick es entonces hecha por el ADN de la nucleasa, y las pilas de los mecanismos de acogida de reparación de producirse. Este proceso implica la separación de capítulo, la recombinación homóloga de la región con muescas con ADN complementario dentro de la célula, y la reparación de la mella. Si Exceso de tipo salvaje (no mutado) el ADN se añade a las células y se utiliza como plantilla, la mutación normal de reparación del ADN se fijará la mutación. Urnov et al han demostrado que hasta un 20% de los cultivos de células que contienen una mutación puede ser en la reparación el laboratorio. Si estas células obtener una ventaja de crecimiento selectivo, las células mutadas finalmente sería reemplazado por células de tipo salvaje.

• receptores de hormonas esteroides: (Eucariotas) En contraste con la mayoría de las hormonas, que se unen a los receptores de superficie celular, las hormonas esteroides (derivados del colesterol) pasan a través de la membrana celular y se unen a receptores citoplasmáticos a través de un dominio de unión de la hormona. Esto cambia la forma de los receptores que se une a un sitio específico en el ADN (elemento de respuesta de la hormona), aunque un dominio de unión al ADN. En una estructura análoga a la del dedo de zinc, Zn ^{2 +} Tetraédrica es coordinado a 4 Cys, en un globular-como la estructura que se une como un dímero a dos idénticos, pero al revés las secuencias de ADN (palindrómico) en el bosque más importantes. (Un ejemplo de un palíndromo: Capaz era yo antes de que yo vi Elba.)
• cremalleras de leucina: (Eucariotas) Estas proteínas contienen tramos de 35 aminoácidos en que reiteradamente Leu se encuentra en intervalos de 7 de aminoácidos. Estas regiones de la forma de proteína hélices anfifílicas, con Leu en un lado. Dos de estas proteínas pueden formar un dímero, estabilizado por la unión de estas hélices anfifílicas entre sí, formando una bobina en espiral, tanto como en la miosina, la proteína muscular. La cremallera de leucina representa la proteína de unión al dominio de la proteína. El dominio de unión al ADN se encuentra en los primeros 30 N-terminal de aminoácidos, que son básicos y forman una hélice alfa cuando la proteína se une al ADN. La cremallera de leucina funciona entonces para traer a dos proteínas de unión a ADN en conjunto, permitiendo que el N-terminal de las bases de las hélices para interactuar con el bosque de las principales de ADN en una base de manera específica.

Figura: cremalleras de leucina (hecho con VMD)

 

Chime:Leucina Zipper  Jmol:Leucina Zipper

VINCULANTE y la levadura Two-Hybrid System en el estudio del interactomas-Biacore

Los factores de transcripción debe hacer más que obligar a los objetivos de las fuentes (elementos de respuesta) sobre el ADN. También deben interactuar y activar la maquinaria de transcripción, incluyendo la RNA polimerasa y otras proteínas reunidos, para la transcripción de ocurrir. Para llevar a cabo ambas tareas, los factores de transcripción de proteínas por lo general constan de dos dominios independientes y separarse a menudo, un ADN Bncontrar Domain (ADN-BD) Y un TieneNABLING Domain (AD). Las tiras cómicas por lo general contiene la unión al ADN motivos discutidos anteriormente. En una hazaña inteligente de la manipulación genética, el científico ha tomado la parte del gen que codifica el factor de transcripción de ADN-BD y se funde a un gen de una proteína llamada la proteína cebo. Asimismo, la otra parte del factor de transcripción del gen que codifica la AD que se fusiona con un gen de otra proteína, la meta, Que podría obligar a la proteína cebo. Plásmidos con el gen de las construcciones se suman a la levadura. Por sí mismos, el BD separados y AD no puede activar la transcripción de un gen en levadura que es inducible por el factor de transcripción conjunto. Sin embargo, si la DB Bait-gen y el AD-genes diana son a la vez añadido el plásmidos separados, y la fusión de ambos genes se transcriben y, finalmente, concentraciones, las fusiones ARN traduce en proteínas, a continuación, la transcripción del gen inducible puede ocurrir si el cebo y la parte de dominio de destino de la fusión las proteínas se unen unos a otros, permitir dominio de unión de la BD y el dominio de AD a sus lugares de destino, dando lugar a la transcripción de genes. Este de levadura de dos híbridos método ha permitido la determinación de la proteína de unión socios, parte de lo que ahora se denomina interactomas.

Figura: De levadura de dos híbridos

 

Indagación sobre la interactomas-Biacore: OTROS MÉTODOS Otros métodos similares han sido desarrolladas para asignar bate proteína trampa de interacciones entre proteínas en la levadura. De Complementación de fragmentos de proteínas (PFC)(Tarasov, K. et al): un gen que codifica un fragmento de un reportero de la enzima, la dihidrofolato reductasa (DHFR), se fusiona con un gen de una proteína de cebo y se inserta en un plásmido. Un fragmento de segundo gen que representa el segundo de un periodista enzima está relacionada con los genes de proteínas posible objetivo. En una célula transformada con plásmidos, el gen reportero en última instancia, mostrar la actividad enzimática sólo si la proteína cebo traducida se une a una proteína diana traducido, permitiendo que los dos fragmentos de la enzima de interactuar y se pliegan en forma colectiva un holo-, la actividad de la enzima activa. El gen reportero fue un mutante de DHFR que era resistente a un inhibidor, metotrexato. DHFR actividad funcional conduce al crecimiento celular en presencia de metotrexato. Figura: De Complementación de fragmentos de proteínas   Tandem afinidad Purificación (TAP)(Rigaut, G. et al) un método genérico de purificación de proteínas para la caracterización de proteínas complejas y la exploración proteoma. Nature Biotechnology 17. 1030 (1999): Un gen de la proteína es un cebo secuencialmente vinculadas a genes que codifican dos etiquetas distintas, una para la proteína A (que une Inmunoglobulina G - IgG) y un péptido de unión de calmodulina (que une la calmodulina proteína en un proceso que requiere de calcio . Entre los genes de las dos marcas es una secuencia de nucleótidos que codifica un corto de la proteasa peptídicos enlazador sensibles. La construcción genética se introduce en la levadura, y la expresión inducida. lisis de la célula son el extracto y se aplica a cuentas de cromatografía de afinidad con covalentemente IgG, que la proteína se une una etiqueta. Después de un extenso lavado de la proteína cebo atado, asociados a proteínas diana, se eluye de la proteólisis de la vinculador péptido. El eluido se aplica a una segunda columna de afinidad con la calmodulina covalentemente. Después del lavado, la trampa y de destino asociados proteínas se eluyen con un quelante de calcio (EGTA o EDTA) como la interacción de la calmodulina con la etiqueta de segundo, la unión del péptido calmodulina, requiere de calcio. eluyen proteína diana se pueden identificar por 2D PAGE o espectrometría de masas. Figura: Tandem Afinidad de Purificación     Una comparación reciente de la Y2H, PFC, y los métodos de PCR se hizo (Jensen, L. y Bork, 2008; Yu, H et al, 2008). Como era de esperar, la Y2H fue en el mejor de determinación de interacciones entre proteínas nucleares, TAP a las proteínas citoplásmicas y abundante, y el PFC de las proteínas transmembrana. Todos sufrir un poco en la identificación de complejos de proteínas transitoria.

Fosforilación y CONTROL DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA

Una forma común de control de la expresión génica es mediante el control posterior a la fosforilación de traslación de los factores de transcripción por el ATP. Este cambio puede activar o inhibir el factor de transcripción en la transformación de la expresión génica. El agregado de grupos fosfato pueden ser necesarios para interactuar directamente vinculante que conduce a gen la transcripción o que podría conducir a un cambio conformacional en el factor de transcripción, lo que podría activar o inhibir la transcripción de genes. Un ejemplo reciente de este último caso es el control de la actividad del factor de transcripción p53. p53 tiene muchas actividades en la célula, se ha primario como supresor del crecimiento de células tumorales. Si una célula se somete al estrés que provoca daños genéticos (un evento que podría dar lugar una célula de transformarse en una célula tumoral), esta proteína se convierte en un factor de transcripción activa, conduce a la expresión de muchos genes, incluyendo aquellos implicados en la muerte celular programada y la regulación del ciclo celular. Estos dos efectos claramente podría "inhibir la proliferación celular. Por lo tanto p53 es un gen supresor de tumores. p53 es generalmente ligada a la HDM2 proteína que regula su actividad por el que conduce a su degradación. señales de estrés conducen a la activación de las proteínas quinasas en la célula (tales como p38, JNK, y cdc2), causando la fosforilación de la Ser 33 y Thr 315 y 81 en p53. Esto conduce a la unión de Pin 1, un peptidil-isomerasa prolil, Que cataliza la trans <=> cis cambios conformacionales de X-Pro límites. Pin 1 parece que se unen sólo cuando se fosforila p53. Los cambios resultantes en la conformación de p53 probablemente lleva a su activación como un factor de transcripción.

Figura: La activación de p53 como un factor de transcripción por fosforilación y cambios conformacionales

 

Factores de Transcripción positivo - la nueva clasificación

Como se infiere de lo anterior, los factores de transcripción pueden ser clasificadas en función de su estructura proteica. Un esquema de clasificación más reciente, basado en la función o actividad de los factores de transcripción, ha sido propuesto por Brivan, Lou y Darnell (Science, 295, pg 813, 2002 ), como se ilustra en el siguiente diagrama de flujo, junto con ejemplos concretos. Las clases de factores de transcripción, que son las siguientes:

• Constitutivamente activa : Siempre están activos en el núcleo de la célula y, probablemente, activar la transcripción de los genes que siempre debe estar encendido;

El resto debe ser activado por algunos medios, que incluyen los que son:

• de desarrollo o tipo de célula específica de Cuyos genes se transcriben (probablemente de una manera regulada) para formar el factor de transcripción que penetra en el núcleo;
• señal de factores de transcripción dependientes de, Que se activan a través de un evento de señalización.

Hay clases de la señal de los factores de transcripción dependientes que son activados por:

• esteroides, ¿Cuáles son derivados del colesterol que pueden atravesar la membrana celular y de esteroides se unen factores de transcripción específicos que a su vez en un conjunto específico de genes, la mayoría de estos factores de transcripción están presentes en el núcleo y no son activados por las hormonas esteroides. Una excepción es el glucocorticoide (receptor de los recursos genéticos) que se encuentra en el citoplasma;
• señal internas derivados de la célula, como las señales de los lípidos internos realizados.
• receptores de superficie celular-ligando;

Hay dos tipos de interacciones ligando-receptor que llevan a factor de iniciación de la transcripción.

• pequeñas moléculas ligando (como la epinefrina) de obligar a los receptores transmembrana que conduce a la formación de segundos mensajeros o señales dentro de la célula, lo que finalmente activar el Ser-la actividad de fosforilación. nucleares pueden convertirse en factores de transcripción fosforilado y activado.
• pequeños ligandos de receptores transmembrana de obligar a que luego se unen y activan los factores de transcripción latentes en el citoplasma, que luego migran al núcleo.

Figura: Los factores de transcripción: Clasificación Funcional

 

VINCULANTE COOPERATIVA DE PROTEÍNAS DE ADN

Acabamos de pasar mucho tiempo estudiando la unión cooperativa de oxígeno a la hemoglobina. Cooperatividad parecía exigir cambios conformacionales en la proteína de multímeros. ¿Es posible obtener de cooperación unión de los ligandos sin cambios conformacionales? En un libro reciente de Ptashne y Gann (genes y Señales, Cold Spring Harbor Press, 2002), se argumenta que se puede y por medio de un mecanismo muy simple.

Debe quedar claro que para activar la transcripción de genes, proteínas de varios factores de transcripción que la Asamblea en el promotor antes de la RNA polimerasa puede transcribir un gen. Hay varias ADN-proteína y proteína-proteína de contactos. Para simplificar este análisis, considere el caso de dos proteínas , A y B, que debe unirse al ADN y el uno al otro para la transcripción de ocurrir.

Figura: Dos proteínas, A y B,

 

La unión de cada proteína solo se caracteriza por una característica Kd, k_nosotrosY K_apagado.¿Qué sucede con k_nosotros y k_apagado para la proteína B, por ejemplo, si A está ya obligado? Se puede imaginar que k_nosotros no cambia mucho, pero ¿qué pasa k_apagado después de la proteína está interactuando con el sitio, tanto su ADN y con una proteína? Si B se disocian de su lugar de ADN, que todavía se celebrará en aproximación a ese sitio debido a su interacción con las proteínas A. Su concentración efectiva sube y fácilmente deben imagen que sería muy pronto para volver a enlazar su sitio de ADN. El efecto neto sería que es evidente k_apagado disminuiría, lo que aumentaría su afinidad aparente y disminuir su Kd aparente (Kd = recordar que k_apagado/ K_nosotros). Por lo tanto antes de la unión de un llevaría a B. cooperativa unión de la proteína

• Animación que muestra La unión cooperativa de B a la proteína de la A-complejo de la DNA.
• Nuclear Receptor de base de datos

Epigentics control de la transcripción de la DNA - la metilación del ADN

El óvulo fecundado es una célula totipotentes. Es decir, a través de una serie de divisiones, sus células descendientes eventualmente pueden convertirse en cualquiera de los cerca de 200 tipos diferentes de células histológicamente. Con la posterior división celular en el embrión en desarrollo, las células se encuentran en diferentes ambientes topológicos de células diferentes y tienen contacto entre las células. A través de la transducción de señales a través de la membrana celular, estas células empiezan a ser diferentes, o Diferenciar, En otros tipos de células. Lo hacen mediante la activación y la inhibición de la expresión de un conjunto diferente de genes para formar un conjunto diferente de proteínas en las células. La mayoría de las células se hacen diferenciación terminal y finalmente (después de la división tal vez un centenar de células) pierden la capacidad de para dividir y por lo tanto, comienzan a morir. Sin embargo, unos pocos tipos de células, llamadas Células Madre, Conservan la capacidad de diferenciarse en otros tipos de células en un proceso de regeneración. Estas células son pluripotentes en que pueden diferenciarse en otros tipos celulares.

¿Cómo las células en división saber qué tipos de genes para transcribir activamente? ¿Cómo pueden tener "memoria" del tipo de células que estaban antes de la división? Esto parece ocurrir sin alteración de la secuencia de nucleótidos del ADN de estas células. El principal mecanismo parece tiene que ser cambiado al patrón hereditario de las modificaciones químicas en el ADN (no muy diferente de la cooperación-o modificaciones post-traduccionales de proteínas) la participación de la metilación / desmetilación (por un metilasa y desmetilasa) de la  citosina en Dinucleótido CpG repite en el ADN. También las proteínas pueden unirse al ADN y el ADN metilado para modificar el curso de la expresión génica en las células hija. Tales modificaciones químicas en el ADN que modifican la transcripción de genes, son ejemplos de epigenética Mecanismos de control de la expresión génica.

Todos ustedes están familiarizados con la clonación de animales a partir del ADN de las células adultas (de Jurassic Park a la clonación real de la oveja Dolly). En este proceso, el núcleo de células somáticas de un adulto (como un cheque de células epiteliales) y se ha Situado en un huevo del cual el núcleo ha sido removido (enucleado). El huevo tiene ahora una gama completa de ADN, al igual que una célula adulta, pero no consiguió el conjunto completo por medios normales - es decir, mediante la recepción de un medio espermatozoides para complementar su propio medio regular. Hay otro problema potencialmente grande. El ADN en el huevo tiene el patrón de metilación de una célula adulta diferenciación terminal. Debe ser reprogramado por desmetilación sometidos a extensas y remetilación al "estado correcto" si la metilación epigenética El huevo tiene una oportunidad para formar un embrión normal, el feto y el adulto. Evidentemente, esto puede ocurrir, como lo demuestra el éxito de Dolly y la clonación de vacas, gatos, cerdos, ratones y perros. Sin embargo, es muy difícil y, probablemente, para lograr explica la baja tasa de éxito de la clonación.

Patrones de metilación pueden dar cuenta de silenciamiento génico (en el que un gen en un par de cromosomas idénticos no se expresa) y la inactivación de un cromosoma X en toda una mujer (que tiene 2 cromosomas X). En general, la transcripción de los genes que están metilados es inhibidos.

Jmol:Methyl-CpG-Binding Domain of Human MBD1 en el complejo con el ADN metilado 

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Patrones de metilación son hereditarios y también están determinadas por las variables de entorno. Un reciente estudio del gen de la neurona específica receptor de glucocorticoides (NRGC1) promotor en el hipocampo mostraron un aumento en la metilación del promotor y la disminución de los niveles de ARNm de la transcripción del gen en las víctimas de suicidio que tenían una historia de abuso infantil en comparación con las víctimas de suicidio que no sufren esos abusos. Estos resultados fueron similares a las encontradas en las ratas que fueron criados en un tercer propicio. El hipocampo está implicado en la respuesta al estrés.

Patrones de metilación pueden ser pasados a las células hija y a los hijos. Esta herencia depende de la unión específica de la metilasa ADN metilado a la CPG en la plantilla capítulo de la nueva replica del ADN, lo que lo posiciona a metilato de la cadena complementaria recién reprodujo en el C hidrógeno unido a la cadena molde G. Esta especificidad de la enzima explica la exigencia de un sitio de la metilación dinucleótido CpG en el ADN, como se muestra a continuación.

Figura: La metilación de CpG

 

La secuencia dinucleótido CpG no está suficientemente representado en el genoma humano, sin embargo, se encuentra en aproximadamente el 60% de las regiones promotoras de los genes. GPC en las regiones promotoras que se transcribe constitutivamente no metilado. ADN metilado fuera de los genes de proteínas ayudan a silenciar a la transcripción de esas regiones . El dinucleótido CpG se encuentra probablemente en baja abundancia ya que si 5 espontáneamente desamina metilo citosina, timina forma que conduzca a una mutación de la CG par de bases AT.

Sin embargo, otra modificación Epigentics covalente se ha descubierto en las neuronas, donde se encontraron altos niveles de 5-hidroximetil citosina. A 5-hidroxilasa metilcitosina también ha sido descubierta. Los dos probablemente tienen amplias funciones en la regulación génica.

Remodelación de la cromatina de expresión génica y

De Control de la transcripción del ADN en las células eucariotas se pensaba involucrar a la Asamblea de muchas proteínas en el promotor en un pre-complejo de iniciación (PIC). Una vez montado, podría obligar a la ARN polimerasa y la transcripción se pondría en marcha. Pero, espere un minuto! ¿No es empaquetado del ADN en el núcleo en Cromatina De los cuales 147 pb de DNA se enrolla alrededor de un núcleo de 4 pares de carga positiva histona proteínas - incluyendo H2A, 2B, 3 y 4 - para formar un nucleosoma, visto bajo el microscopio como cuentas de un rosario?

Chime: nucleosoma   Jmol: nucleosoma

¿No es esta la herida más en fibras de cromatina que se traducen en la imagen clásica de cromátidas hermanas listo para separar la división celular? ¿Cómo podrían los factores de transcripción y la RNA polimerasa reconocer los sitios de destino sobre el ADN dado a este grado de "plegar" y de la condensación del ADN ?

Es evidente que el complejo estado del ADN compactada y su interacción con las proteínas histonas deben ser "remodelado" para permitir la interacción de los factores de transcripción y la RNA polimerasa (que es aproximadamente el mismo tamaño que un nucleosoma) reglamento. La remodelación de la cromatina Es evidente que esto afecta gen transcripción, y es otro ejemplo de los cambios epigenéticos que pueden afectar el fenotipo. El estado de la estructura de la cromatina está regulado por las enzimas que afectan la estructura y función de las histonas modificando químicamente la histona proteínas (a través de la acetilación, metilación, y la fosforilación). Del mismo modo, el ADN en la región del promotor se cambia por las enzimas que remodelan el ADN a través de un ATP serie depende de los cambios. Por ejemplo, cuando las histonas son modificados por acetiltransferasa de histonas (HAT's), Los factores de modelado Otros (SWI / SNF) Son reclutados a la cromatina. Remodelación de la cromatina también se verían afectados por esta fase del ciclo celular de la célula. Por ejemplo, la cromatina condensada cromátidas hermanas en células listo para la división tendría requisitos para la remodelación de la transcripción del gen de la cromatina puede, en forma de bolas en una cadena. remodelación de la misma manera también se trataría de genes específicos.

La siguiente figura muestra cómo se acopla a la remodelación de la formación de la pre-complejo de iniciación de tres genes:

• gen de la levadura HO: activador Swi5p vinculantes los resultados en la interacción de la SWI / SNF La remodelación de la enzima ATP-dependientes, lo que conduce a la unión de acetiltransferasa de histonas (HAT). Estos Facilitar la formación de la pre-complejo de iniciación.
• interferón humano b-gen: secuencias de genes conocidos como activadores, 5 'al promotor, se unen HAT. Cuando se acetilado histonas, SWI / SNF interactúa para remodelar la cromatina y facilitar la formación de PIC.
• humanos de un gen-1 antitripsina: El ICP es preformada y reclutas HAT y SWI / SNF, Que conduce a la transcripción de genes.

Alternancia en la remodelación de la cromatina podría conducir a cambios en la expresión génica, en algunos casos causantes de cáncer. SNF5 es un componente del complejo SWI / SNF y en su forma normal actúa para suprimir tumores (es decir, su gen es un gen supresor de tumores). Mutaciones en SNF5 están asociados con los tumores infantiles poco frecuentes y agresivos. Orkin Stuart ha desarrollado una técnica para alterar los genes en algunas células de ratón para producir un gen invertida que no produce SNF5 funcional. células con esta mutación las células tumorales se vuelven casi de inmediato.

Figura: De la Remodelación de la cromatina y control de la transcripción del ADN

 

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• SNF5 y el cáncer

Vientos de ADN alrededor del núcleo de histonas para formar el nucleosoma. Sin embargo, no las colas de las histonas asociadas a sobresalir de unión al ADN de los nucleosomas, y la función de estas colas es simplemente ser descifrado. Los aminoácidos de estas colas son claramente los "sitios de modificación postraduccional, incluyendo metilación, acetilación, y la fosforilación. Cuando vez, estas colas proporcionarían más sitios de unión para la proteína que podría regular la transcripción y el modelado de la cromatina, modificando así el "código genético". Entender el "código de histonas" y cómo afecta a la transcripción de genes es importante. Por ejemplo, la metilación de Lys 9 en la histona 3 conduce a la unión de la proteína asociada a la heterocromatina, lo que lleva a la inhibición de la transcripción de genes (un ejemplo de silenciamiento Epigentics). acetilación de las colas generalmente conduce a la activación de la transcripción de genes en ese sitio. acetilación de residuos de Lys convierte a amidas y elimina la carga positiva de la amina. Esto daría lugar a interacciones electrostáticas disminuyó entre el ADN y las proteínas histonas, haciendo que el ADN más disponible para la interacción con los factores de transcripción y la ARN polimerasa.

Los cambios epigenéticos (a través de la metilación del ADN y acetilación, metilación, y la fosforilación de las histonas) que provoca la remodelación de la cromatina puede cambiar el fenotipo (características del individuo), como demuestra el hecho de que los gemelos idénticos eventualmente pueden divergir de manera que las propensiones de sus efectos a la enfermedad. Las diferencias en la dieta y el estilo de vida, que pueden alterar la propensión de enfermedades, podrían ejercer sus efectos a través de los cambios epigenéticos en la expresión génica. El Humanos Epigenome Consorcio está desarrollando un catálogo de diferencias en los patrones de metilación en el genoma humano que puede estar correlacionado con el riesgo de enfermedad.

El nucleosoma es de aproximadamente el mismo tamaño que la ARN polimerasa. ¿Cómo la ARN polimerasa puede unirse a su promotor, si se envuelve alrededor de una respuesta nucleosoma? Una obvia es que los nucleosomas no se distribuyen equitativamente en el ADN cromosómico, y quizás ni siquiera encontrar en la promotora sitios en el ADN. Rando et al. han estudiado la distribución de los nucleosomas a lo largo del genoma de la levadura. Se ADN internucleosomal abierto, con nucleasa dejando atrás la nucleasa protegidas de ADN. Se separaron el ADN de la envolvente de las proteínas de los nucleosomas, y etiquetados con fluoresceína. Luego, de DNA total fue aislado y fragmentado , y marcado c

on rodamina. Añadieron tanto marcado fluorescente fragmentos de los microarrays encuentra con superposición de 50 cromosomas de la levadura BP 3 fragmentos. Igualdad de rojo y verde fluorescente en un lugar determinado de la matriz se plantearía si los fragmentos de ADN marcada con fluoresceína estaban protegidos por el nucleosoma de las partículas fundamentales de la proteína. Baja verde a la fluorescencia roja se plantearía si el DNA marcado con fluoresceína no estaba protegida por el nucleosoma.

Desde un punto de vista termodinámico, afinidades vinculante para el núcleo de la proteína nucleosoma debe ser la misma en cualquier parte del ADN cromosómico. Esto llevaría a la predicción de que los nucleosomas se unen al azar a lo largo del ADN en todos los lugares. que conduce a una proporción constante de la fluorescencia verde al rojo en la matriz. Es decir, no habrá señales de distrito de la matriz, sino más bien una mancha de salida de la señal cuando el ADN fue extraído de células de levadura muchos. Los datos reales muestran fluoresceína Sharp / señales de rodamina y fue compuesto con el hecho de que el 70% de los nucleosomas se coloca en la misma posición en el ADN de células distintas. centros promotores de genes activos que generalmente no eran ocupados por los nucleosomas. No estaba claro si estos sitios siempre están libres de nucleosomas o factores de transcripción de proteínas y ARN polimerasa porque las proteínas fundamentales nucleosomal a deslizarse lejos de los sitios de promotor.

Los trabajos recientes sugieren que las posiciones de los nucleosomas a lo largo del ADN está codificada en parte por la secuencia de ADN en sí, y añadió otro "código genético" que controla la expresión génica. ADN debe doblarse alrededor de los nucleosomas. Ciertas secuencias de ADN de doble cadena son más flexibles que otros, y El se espera que tengan una mayor probabilidad de estar involucrado en nucleosoma compleja y menos accesible para la transcripción. Segal et al nucleosoma aislado secuencias de ADN de la envolvente y desarrollado un modelo informático para predecir qué secuencia de ADN sería flexible y por lo tanto ser capaces de forma fácilmente complejos de nucleosomas. En otras palabras, se calcula que las secuencias de ADN con alta afinidad por los nucleosomas. Llegaron a la conclusión de que el 50% de la posición de los nucleosomas puede ser explicada por ciertas secuencias de ADN con mayor afinidad de la octámero histonas. Encontraron ocupación nucleosoma baja en importantes sitios de regulación, tales como sitios de iniciación de la transcripción. regiones del cromosoma que codifica el tRNA y el rRNA, que son altamente expresadas, se encontró que la ocupación de los nucleosomas baja.

CONTROL DE LAS MOLÉCULAS EXPRESION GENICA por el ARN

¿Cómo se explica la creciente complejidad de los organismos como los seres humanos? Como se discutió en el capítulo de ADN, no es el número de cromosomas, o incluso el número de posibles genes de un organismo. Una gran diferencia entre bacterias y células humanas, por ejemplo, es El porcentaje de ADN que codifica para las proteínas. En las bacterias, la mayoría de los códigos de ADN de las proteínas, pero en las células eucariotas, la mayor parte del ADN (hasta el 98%) es "basura", ya que el código no para las proteínas. El ADN consiste en intervenir en las secuencias de ADN que codifica para una proteína determinada, y entre las secuencias de genes. Hasta el 98% del ARN transcrito en las células humanas se deriva de esta basura "," ADN. ¿Qué función tiene este ARN sirve? Nueva evidencia muestra que esta transcripción ARN se une a otras moléculas de ARN como ARNm (para inhibir su traducción) al ADN (para controlar la transcripción del gen) o las proteínas (para modificar la transcripción de genes, así). Estos procesos se llaman La interferencia de ARN (RNAi)

MicroRNAs (miRNAs) se forman cuando una enzima llamada Dicer se unirá una serie de genes ARN de transcripción en las células animales que contiene un diagrama de estructura de la horquilla bucle. Dicer reconoce las regiones de doble hélice del tallo. El ARN se rompe podría obligar a una gran cantidad de ARNm, inhibiendo la traducción. Si la complementariedad de los ARNm y miRNA es menos que ideal, y luego ligar de miRNA al ARNm sólo puede atenuar la traducción del ARNm ..

Otra clase de ARN, short interfering oro silencing ARNs (siRNAs) También se puede deducir con la traducción del ARNm. SiRNAs se forman cuando la Dicer Cleaves Viral ARN de doble cadena en las células infectadas. (DsRNA virus producen a menudo durante su ciclo de vida). Estos difieren de los miRNAs en siRNA que no se derivan de la transcripción de genes discreta acogida.Dicer obras de cortando el dsRNA para formar un ARN bicatenario pequeñas entre 20 y 25 pares de nucleótidos de largo llamada siRNAs. Éstos pueden entonces se unen a un complejo proteína llamada RISC (RNA --induced silencing cOMPLEX), que promueve la desintegración de la siRNA. Un complejo de RISC, y una de las cadenas cortas de ARN de la siRNA puede obligar a tramos complementarios en el ARNm de un gen específico (viral o de acogida) e inhiben la traducción del ARNm en una proteína. La inhibición se produce al complejo RISC Cleaves El RISC siRNA complejo ARNm. (es decir, uno de los componentes en el complejo RISC es una nucleasa de ARN.) Este mecanismo podría estar vinculado a los mecanismos de defensa de las células infectadas por virus mediante la inhibición de la traducción del ARNm viral.

Jmol: dsRNA 

Cuando se unen siRNA para acoger ARNm de secuencia complementaria para formar un complejo dsRNA, inhibe la traducción del ARNm. Esta técnica se ha utilizado recientemente para determinar las funciones de los productos de los genes en el gusano nematodo, C. elegans. Este organismo cuenta con unos 20,000 Qué genes codifican proteínas. Kamathk y. al. se han alimentado estos gusanos E. Coli Transformado con el plásmido de ADN destinado a dsRNA produjo en la transcripción, una cadena de que era un complemento a las secuencias de ARNm en el gusano. Plásmidos que contienen casi 17.000 diferentes genes que codifican dsRNA fueron construidos y utilizados para "knock out" la expresión génica mediante la formación de complejos de dsRNA del ARNm con el ARNi. cambios fenotípicos en el organismo fueron estudiadas. Cerca de 1700 de los experimentos dsRNA llevado a observables (fenotípicas) Cambios en el organismo. genes cuya inactivación fue letal (y por tanto son esenciales para la supervivencia) fueron en general los que habían homólogos de todos otro organismo, mientras que aquellos asociados con los cambios no letales tenían más probabilidades de ser homólogos a los genes en organismos superiores y, más recientemente desarrollado. También observaron que selectivamente genes influidos metabolismo de los lípidos mediante la incorporación de una etiqueta fluorescente unido a que los depósitos de lípidos en el organismo. Around 300 genes se han encontrado a la influencia de fluorescencia y, por tanto regular la acumulación de grasa en el organismo.

Figura: Interferene ARN: Sentido y el silenciamiento

 

• Animación: RNAi de IMGENEX

De RNAi es la base de una nueva industria emergente. Muchas compañías ofrecen kits y software libre que hacen estudios simples de RNAi. Invitrogen es una de esas empresas.

Figura: RNAi silenciamiento de genes mediante el uso de genes en mamíferos haripin corto de ARN.
Crédito: http://www.invivogen.com/sscat.php?ID=14

 

• siRNA Asistente de Invitrogen

Jmol: Dicer 

MiR dos grupos se han suprimido-155 y miró a los efectos en las células inmunitarias en ratones. Función de las células inmunitarias en B, T y las células dendríticas se vio afectada, lo que lleva a la muerte de los animales cuando son expuestos a la salmonela después de que fueron vacunados. Animales en ambientes estériles no mostró efecto. En contraste con los golpes de gracia de genes codificadores de proteínas, estos ratones afecta a la transcripción de múltiples genes. Knockout de miR-208 problemas cardíacos causados en los ratones colocados en un ambiente estresante. Estos experimentos indicaron que algunas enfermedades genéticas pueden surgir por mutaciones en la no -- las regiones que codifican proteínas del genoma.

Recientemente, un nuevo mecanismo en el control de la expresión génica se ha ofrecido que incluye el Reglamento de la traducción del ARNm. MRNA debe tener una secuencia, la secuencia Shine-Delgarno, que le permite unirse a los ribosomas. Si un ligando se une a este sitio ARNm no pudo enlazarse al ribosoma y la traducción sería inhibido. Tal es el caso de las proteínas mRNA implicada en el transporte y la síntesis de las vitaminas B1 (tiamina) y vitamina B12 (adenosil cobalamina). Tiamina pirofosfato de tiamina y se demostró que se unen a de la secuencia líder de una E. ColiARNm que participan en la biosíntesis de tiamina y de inhibir la traducción del ARNm. Este mecanismo alostérico para la inhibición tiene sentido fisiológico ya que la presencia de altos niveles de B1 celular se obviative la necesidad de su síntesis o el transporte.

Reconocimiento de ADN de doble cadena dsRNA viral y bacteriana por el sistema inmune.

Antes de dejar el tema de la ARN / interacciones de las proteínas, considere cómo una célula se auto detectar los virus y bacterias. Sería beneficioso para el organismo si el sistema inmunológico pueda reconocer y responder a muchos tipos de bacterias, virus, hongos, protozoos o por unión al objetivo común de ellos. Por ejemplo, sería deseable disponer de un solo tipo de células, tales como los macrófagos de barrido con un sistema de reconocimiento que podría reconocer un patrón molecular común, como se encuentra en LPS bacterias gram negativas. La parte del sistema inmune que tiene esta capacidad es llamado sistema inmunológico innato. Las células del sistema innato (células dendríticas, macrófagos, los eosinófilos, etc) tienen receptores (Los receptores tipo Toll o TLR 1-10) Que reconocen el común patrones moleculares asociados a patógenos - PAMPS (a veces llamado MAMP - microbio asociados patrones), Lo que conduce a la unión, la inmersión, la transducción de señales, la maduración (diferenciación), la presentación de antígenos y las citocinas / liberación de quimiocinas de estas células. Tomemos por ejemplo las células dendríticas, que reside en los tejidos periféricos y actuar como centinelas. PAMPS Se puede obligar a qué incluyen:

• CHO / lípidos en bacterias de la superficie (LPS)
• manosa (CHO encuentra en abundancia en las bacterias, las levaduras
• dsRNA (de virus)
• CpG nonmethylated motiff en el ADN bacteriano

Receptores TLR se expresan en la superficie celular para el reconocimiento de la Pampa externa sobre los invasores extranjeros. Sin embargo, desde bacterianas y virales pueden ser devorado, sería óptimo tener reconocimiento intracelular de los ácidos nucleicos virales y bacterianas, así. Estos son reconocidos por los TLR intracelular en la celda de los ácidos nucleicos después de la que han asumido en las células por endocitosis. La siguiente figura muestra cómo viral y bacteriana en endosómica vesículas, puede estar vinculado por TLR membrana endosómica. Jmol un modelo de una estructura reciente de TLR3 y dsRNA se muestra a continuación.

Figura: Endosómica TLR3 interacción con el ARN y el ADN extranjeros

 

Jmol: TLR3: dsRNA complejo 

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La inflamación también puede surgir cuando el daño del tejido normal debido a una lesión, que expone las moléculas que normalmente se encuentra en el interior de la célula del sistema inmunológico. Dichas moléculas son proteínas del grupo de alta movilidad (asociada con la cromatina), proteoglicanos y ácidos nucleicos. Éstas son referidas como Patrón molecular asociado a daños (DAMP) moléculas. proteína intracelular existe normalmente en un entorno de reducción de manera que cuando están expuestos a las condiciones oxidantes del medio extracelular, covalentes y los cambios conformacionales que pueden derivarse

 

Especies eucariotas COMPLEJIDAD Y CONTROL DE transcripción del gen de

La creciente complejidad de los organismos eucariotas se pensaba que se derivan de un número creciente de genes. Esta hipótesis simplista no ha sido validada por los resultados de la secuenciación y anotación de los genomas de muchos organismos eucariotas. Compare estas estadísticas: el número de genes putativos en el simple gusano nematodo C. ronda Elegans, la mosca Drosophila y el humano son aproximadamente 20.000, 14.000, y cerca de 30.000. Parece que hay poca correlación de complejidad de las especies con el número de genes. Otros mecanismos posibles para aumentar la complejidad de un determinado tamaño del genoma incluye la producción de proteínas diferentes de el mismo gen a través de empalme diferencial de los transcritos de ARN y ADN reorganización como ocurre en las células inmunes a producir el gran repertorio de moléculas de anticuerpos posibles necesaria para el reconocimiento de moléculas no propias (tales como virus y bacterias). Estos mecanismos no pueden dar cuenta de la increíble complejidad de la especie humana. Levine y Tjian han propuesto otros dos mecanismos que podrían representar el aumento de la complejidad. complejidad que surgen de la serie de patrones de expresión génica y la participación de la participación de los no proteico-regiones codificantes del genoma, en los seres humanos que representa hasta el 98 % del genoma. Un mecanismo requiere que el actual de mayor número y complejidad de las secuencias de ADN reguladoras (potenciadores, silenciadores, promotores) en organismos más complejos. Dado que estas secuencias están en el ADN (la molécula que se transcribe), se les llama cislas secuencias reguladoras. El segundo mecanismo implica un aumento en la elaboración y la complejidad de las proteínas (trans-elementos reguladores) que regulan la expresión de genes en organismos más complejos .. Estas proteínas podrían incluir factores de transcripción, proteínas que interaccionan con secuencias potenciador, y proteínas implicadas en la remodelación de la cromatina (descrito anteriormente). Ellos estiman que hasta un tercio del genoma humano (1 mil millones de pares de base) podría estar implicado en la regulación de la transcripción de los genes. Además, el 5-10% de todas las proteínas expresadas por genes parecen regular de transcripción de genes. Parece que hay alrededor de 300, 1000 y 3000 el factor de transcripción en levadura, Drosophila y C. elegans y los seres humanos, respectivamente. No se trata de uno por cada factor de transcripción de genes en la levadura, pero uno de cada diez en los seres humanos.

En los eucariotas simples, los elementos reguladores de la CEI se incluyen el promotor (la región de caja TATA), aguas arriba y las secuencias reguladoras (potenciador) y silenciadores de unos 100-200 pares de bases del promotor. En las especies eucariotas más complejos como los humanos, el promotor es más compleja, que contiene la caja TATA, secuencias de iniciador (INR) y promotor de los elementos intermedios (DPE). cis ascendente elementos reguladores (hasta a 10 kb del promotor) se incluyen varios potenciadores, silenciadores, y los aisladores. mayoría de los promotores tienen caja TATA, en unión a TATA (proteína TBP) se une. ubicadas río arriba, a su vez regulan la unión de la PDD.

• Los promotores de eucariotas y las regiones reguladoras
• Eucariotas con múltiples aparatos de transcripción generales
• Biológica Reglamento: BIOBASE - Regulación Génica (TRANS-FAC 6,0 sitio público con inscripción gratuita)

Genómica Comparativa - Gene Expression diferencias entre humanos y chimpancés

Nuestro pariente más cercano es el chimpancé biológica, que se separaron de un ancestro común de los dos cerca de seis millones de años. La secuencia de ADN parece ser 98,6% idénticos (no sólo homóloga). Si estamos tan cerca en nuestra impresión azul genéticos , ¿cómo podemos ser tan diferentes. Hay muchas conjeturas posibles que pueden ser contestadas mediante la comparación de los genomas del chimpancé y el humano. Nuestros genes son probablemente muy similar. La gente sospecha que hay dos tipos principales de las diferencias que hacen que nuestras especies difieren:

• nuestros genes son muy similares objetivo se transcriben de manera diferente en las dos especies. Los datos recientes muestran que los tipos de ARN transcrito por los hígados de humanos y chimpancés son muy similares, pero muchos más genes se transcriben en el cerebro humano en comparación con los cerebros de los chimpancés.
• Los seres humanos pueden haber perdido los genes (o su función) que se requieren para la supervivencia de chimpancés en la selva. La observación de que los chimpancés son resistentes a muchos de los agentes patógenos de enfermedades que afectan a los seres humanos (virus de inmunodeficiencia como el VIH, el virus de la gripe, la hepatitis B / C parásito de la malaria) podría explicarse por la pérdida de "protección" de genes en seres humanos. Además, enfermedades cardiovasculares y ciertos tipos de cáncer son más raros en los chimpancés. Los seres humanos, aparentemente, han "perdido" los genes implicados en el pelo del cuerpo, la fuerza y de maduración temprana rasgos que el chimpancé se adaptan a la vida en la selva.

Ya hablamos anteriormente de un ejemplo de una pérdida de la función génica en humanos. Hemos perdido a un gen hidroxilasa implicados en la formación de ciertos tipos de ácidos siálico, específicamente Nácido glycolylneuraminic, que se encuentra en glycogroteins de la superficie celular de los mamíferos no humanos. Los chimpancés tienen un receptor de lectina de este ácido siálico. Trabajos recientes han demostrado que la falta humanos de una Arg crítico en nuestra versión de la lectina que se reconozca Nglycolylneuraminic-ácido, lo que no puede obligar a este ligando. Por lo tanto los dos pares de genes implicados en estos tipos de interacciones (de células: la célula) no están presentes. Dado que las moléculas de ácido siálico a menudo participan en patógeno: acogida vinculante, estas diferencias en los seres humanos frente a los chimpancés podría explicar la diferencia en la susceptibilidad a la enfermedad como se mencionó anteriormente.

Con respecto a la transcripción de genes en el cerebro, Lai et al. han encontrado una mutación en el gen FOXP2 humano, un factor de transcripción, en una familia que tiene dificultades importantes en el control de los músculos necesarios para la articulación de las palabras. Esta mutación también causa problemas en el procesamiento del lenguaje y construcción gramatical. Comparación de los genes humanos normales con otros genes de los primates muestran claras diferencias en el gen humano que pueden haber conferido a la capacidad humana de usar el habla.

22 cromosomas del chimpancé es homólogo al cromosoma humano 21. Recientemente, secuenciadores han encontrado cambios en el 1,44% de un solo nucleótido entre los dos, un resultado en línea con la homología general entre el ADN de humanos y chimpancés del 98,6%. El hallazgo sorprendente fue 68,000 inserciones y eliminaciones (indeles ) en comparación con los seres humanos. La mayoría fueron cortos (<30 nucleótidos). Los más de 300 elementos genéticos móviles que se trate (transposones). Los seres humanos tienen una incidencia mucho mayor de inserciones llamada Alu repite. Una elevada cifra de 20% de genes homólogos muestran los niveles de expresión muy diferentes.

En septiembre de 2005, un proyecto de secuencia del genoma del chimpancé y su comparación con el genoma humano se publicó la secuenciación del chimpancé y del consorcio para el análisis. Éstos son algunos de sus hallazgos:

• Las sustituciones de un solo nucleótido ocurren en una tasa media de 1,23% entre las copias del genoma humano y del chimpancé ".
• "La inserción y supresión (indel) eventos son menos numerosas que las sustituciones de un solo nucleótido, pero el resultado en el 1,5% de la secuencia de eucromáticas en cada especie de ser de linaje-específicos".
• "Existen diferencias significativas en la tasa de inserción de elemento de transposición: a corto elementos intercalados (Sines) han sido tres veces más activo en los seres humanos, mientras que los chimpancés han adquirido dos nuevas familias de antirretrovirales elementos".
• "Proteínas ortólogos en humanos y los chimpancés son muy similares, con ~ 29% eran idénticos y el orthologue típicas que difieren en sólo dos aminoácidos."

Desde sus genomas son más de 3 millones de pares de base, una diferencia del 2% significaría unos 60 millones de diferencias. El número real parece ser de 35 millones de diferencias de un solo nucleótido (sin contar las inserciones y eliminaciones). La mayoría de estos no se espera que esté en genes y tienen poco efecto general sobre las diferencias fenotípicas entre las especies. Encontrar la diferencia crítica se consume mucho tiempo, y puede que requieren la secuenciación de genomas de otros primates.

En su resumen de la declaración, Li y Saunders discutir los cambios en los nucleótidos que son sinónimo (no hay cambios en aminoácidos de la proteína) y no sinónimas. Si una región de un gen no puede tolerar los cambios que conducen a alteraciones amino ácidos (es decir, los nucleótidos están bajo presión selectiva importante no cambiar), la tasa de sustitución nonsyonymous sería inferior a la tasa de cambios sinónimos. Si los cambios pueden ocurrir sin estructura, la pérdida de la función de la proteína, los dos tipos serían similares. comparación de más de 13.000 pares de genes de ambos organismos, se encontró que el índice no sinónimos que aproximadamente el 25% de la tasa de sinónimos. Por ello la mayoría de los genes se conservan entre las especies y no se espera que contribuya a la diferencia fenotípica en los organismos. De los genes que mostraron mayores no sinónimos las ratas, no fueron obviamente vinculada a la función del cerebro, pero muchos estuvieron involucrados en la función inmune.

Las mayores diferencias entre los genomas fueron inserciones / deleciones (indeles, que suman alrededor de 5 millones de euros) y la duplicación de genes, no una mutación de un solo nucleótido. Inserta suelen ser de dos clases. Inserta incluyen tramos de la replicación del ADN y la adición de transposones ( "Saltos" de genes o elementos móviles de ADN). Estas pueden ser pequeñas (como las repeticiones Alu) o larga (como inserciones L1). En el genoma humano existen 7000 a las secuencias de Alu en los chimpancés hay 2300. Ambos tienen aproximadamente equivalente número de inserción de Li. Habida cuenta de que hemos perdido algunas características (como el pelo y la fuerza), tal vez algunos genes de chimpancé que se perdieron en el genoma humano por la presencia de indeles 53. dichos genes se han encontrado los genes humanos. Quizás el mayor cambio entre los chimpancés y los seres humanos es una expresión alterada de genes, que no fue estudiado en este trabajo.

En otro estudio realizado por Xiaoxia Wang et al, se hizo una comparación de "pseuodgene" en los seres humanos (los genes que las mutaciones adquiridas en el pasado que han interrumpido su expresión de proteínas funcionales y los compararon con los genes correspondientes de los chimpancés que todavía mantienen la función (es decir, conducen a proteínas funcionales). Análisis mostró que el seudogenes identificados no fueron distribuidos aleatoriamente entre las diferentes clases de genes. Más bien, se concentraron en los genes que codifican proteínas de receptores olfativos, los receptores del sabor amargo, y los genes del sistema inmunológico. Homo sapiens tienen un sentido del olfato disminuido mucho. receptores Bitter probablemente se menos importantes que los seres humanos ¿Qué cambió de las plantas contienen muchas toxinas amargo a las carnes. Atribuyen los cambios en los genes del sistema inmune a los cambios en el entorno que pueda conducir a gen perder si la intensidad de la respuesta inmune, y el equilibrio de auto inmunes y el reconocimiento no propio podría ser modificado en diferentes condiciones ambientales.

 

Otra diferencia importante se ha observado en el número de genes de copia. El trabajo de Hahn et al muestra que el número de copias de genes entre humanos y chimpancés difieren en 6,4%. Después de apartarse de un ancestro común, humanos lograron 689 copias de algunos genes, en comparación con 26 para los chimpancés . Del mismo modo, los humanos perdieron cerca de 86 copias de los genes en comparación con los chimpancés en un pierden de 729 copias.

Lo que mantiene especies? Obstáculos a los híbridos entre especies.

Nuevas especies parecen surgir, de acuerdo con la teoría evolutiva, cuando los miembros de una especie a ser geográficamente aisladas. Cada aumento de población separados diferentes mutaciones en sus genomas, que confieren ventajas adaptativas a cada población difieren en su entorno. Con el tiempo las diferencias de tiempo suficiente, genéticos obstáculos para la producción de híbridos entre las poblaciones viables de desarrollar, llevando a la divergencia de las poblaciones en especies distintas. Esta explicación racional no da un mecanismo molecular específica que causa el fracaso híbridos. En la década de 1930, Dobzhansky y Muller propone que los cambios en dos genes que producen proteínas que interaccionan podría explicar el fracaso híbridos entre especies. Estos genes presumiblemente mutar a una velocidad mayor de lo habitual. dentro de una especie, los dos genes que co-mutar a tasas similares para producir proteínas que aún interactuar, pero de rápido cambio evolutivo en los demás "antes de ser pareja de especies nuevas" gen haría híbridos producidos a partir de apareamiento estériles en el mejor, o letales.

Brideau et al. han encontrado un par de genes, de rescate Lethal híbrido (LHR), que en Simulans Drosophila funcionalmente se separaron, y el rescate macho híbrido (HMR), en Drosophila melanogaster Que también tiene funcionalmente divergentes. Híbridos F1 descendencia masculina de los cruces de morir. El gen en HMR D. melanogaster objetivo es un factor de transcripción. HMR El gen es uno de los genes más rápida evolución en el genoma. La función exacta del gen LHR se sabe está asociada con cromatina condensada (heterocromatina).

 

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Puertas corredizas de modelo para la proteína / ADN Interacciones

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